Uniwersytet Karola w Pradze swoje powstanie zawdzięcza Luksemburgom. Jego fundator, Karol IV, był człowiekiem wykształconym w teologii i prawie rzymskim. W swojej autobiografii to właśnie mądrość podkreślał jako cechę idealnego władcy. Zgodnie z ideą współczesnego mu filozofa Mikołaja z Oresme uznawał świat za ogromny zegar, „którego wszystkie koła poruszają się w najlepszej możliwej zgodności”. Dzięki staraniom króla papież Klemens VI bullą z 26 stycznia 1347 r. powołał studium generale dla królestwa Czech. Król 7 kwietnia kolejnego roku nadał nowo powołanej uczelni przywileje, zaś 14 stycznia 1349 r. jako król rzymski ponownie potwierdził swoją fundację. Związek uczelni z fundatorem zaakcentowano zgodnie z ówczesnym zwyczajem na pieczęci – klęczący Karol ofiarowuje św. Wacławowi, patronowi królestwa, kodeks. Na dwóch tarczach przedstawiono symbol króla Czech (lew) i króla rzymskiego (orzeł). W otoku napisano „Pieczęć Uniwersytetu Praskiego” (Sigillum Universitatis Scolarium Studii Pragensis).
Początkowo uniwersytet miał cztery fakultety; pierwszym był sztuk wyzwolonych, jego ukończenie umożliwiało studiowanie na pozostałych: teologii, medycyny i prawa. Szybki rozwój uczelni, zwłaszcza w zakresie prawa i teologii, uczynił z niej jeden z najwspanialszych ośrodków intelektualnych na kontynencie. Akademia miała prawo nadawać tytuły bakałarza, magistra i doktora każdej z tych dyscyplin. Pierwsze nadano już 10 lat po fundacji. W 1366 r. cesarz Karol IV ufundował kolegium z salami wykładowymi i mieszkaniami wykładowców, które na jego cześć nazwano Carolinum. Z czasem tą nazwą określano całą uczelnię. Władca wyraził też zgodę na założenie wyższych uczelni w Cividale i Lukce, łącznie przyczynił się do powstania dziesięciu uniwersytetów.