Bohaterem filmu jest nieporadny uczeń szkoły średniej Peter Parker, który zostaje ugryziony przez genetycznie zmodyfikowanego pająka podczas wystawy insektów na Columbia University. Pod wpływem jadu nastolatek nabiera muskułów, poprawia mu się wzrok i refleks. Dzięki mackom, które wyrastają na skórze, może wspinać się na wieżowce Manhattanu, a pajęcza sieć, którą wytwarza na zawołanie, ułatwia mu przemieszczanie się z miejsca na miejsce. Mimo tej drastycznej fizycznej metamorfozy Peter Parker pozostaje skromnym, nieśmiałym nastolatkiem. Ukrywa przed wszystkimi swoje niezwykłe cechy i nie ma odwagi powiedzieć swojej szkolnej koleżance i sąsiadce Mary Jane Watson, że jest w niej zakochany.
Akcja komplikuje się nieco, kiedy ukochany wujek Petera ginie z rąk złodzieja samochodów. Decyzja, żeby zwalczać zbrodnie, podjęta pod wpływem tego wydarzenia, prowadzi w rezultacie do pojedynku na śmierć i życie z maniakalnym naukowcem Normanem Osbornem, który pod wpływem własnych eksperymentów zamienia się w siejącego trwogę i zniszczenie Zielonego Goblina (Green Goblin). Największy wróg Petera jest na dodatek ojcem jego najlepszego przyjaciela, z którym rywalizuje o względy dziewczyny.
Trudno byłoby zatem mówić o oryginalności fabuły. Krytycy zgodnie uważają, że o sukcesie filmu decyduje umiejętne łączenie elementów przygodowych z osobistymi rozterkami bohatera. Pozwala to widzom łatwo się z nim identyfikować. Podkreślają oni, że jak w komiksie, który liczy sobie już 40 lat, człowiek-pająk jest przede wszystkim kimś, kto boryka się ze zwykłymi, w tym sercowymi, problemami. „Wspaniałość filmu polega na tym, że inteligentny scenariusz i aktorstwo są mocno osadzone w świecie nastolatków. Peter jest superbohaterem, który pamięta, kim był wcześniej, kiedy nie był ani super, ani heroiczny.