Nie odziedziczyła po matce ani urody, ani talentów politycznych, ale wydarzenia uczyniły ją pierwszoplanową i popularną osobą w państwie. Anna Jagiellonka była trzecią córką Bony Sforzy i Zygmunta I Starego (pan. 1507–48). Wychowywała się z dwiema siostrami – Zofią i Katarzyną – z dala od głównego dworskiego nurtu. Nie była ani szczególnie urodziwa, ani inteligentna (w przeciwieństwie do najstarszej Izabeli), jednak odebrała wykształcenie typowe dla królewny: znała łacinę i włoski, uczyła się sztuki haftu i tańca.
To przyjemne dworskie życie przerwała śmierć ojca w 1548 r. Ostry konflikt między Boną a Zygmuntem Augustem, który zawarł skandaliczny ślub z Barbarą Radziwiłłówną, skończył się przeprowadzką królowej matki z córkami do Warszawy. Anna miała wówczas 25 lat, ale ani brat, ani matka nie zadbali przez kolejne lata o jej zamążpójście. Dodatkowo Bona po ośmiu latach energicznych rządów w swoim mazowieckim państwie zdecydowała się na powrót do ojczyzny, nie zostawiając środków na utrzymanie dwóch najmłodszych córek (Izabela i Zofia były już mężatkami).
Anna i Katarzyna musiały przeprowadzić się na dwór brata do Wilna. Zygmunt August podejmował niemrawe próby wydania Anny za mąż (za księcia duńskiego Magnusa lub kurlandzkiego Gottharda Kettlera), ale ostatecznie to młodsza Katarzyna poślubiła księcia finlandzkiego Jana Wazę. Osamotniona Anna wróciła do Warszawy, gdzie wiodła dość wygodne życie (m.in. dzięki stałym wpływom z dóbr mazowieckich). Po sejmie lubelskim (1569 r.) dołączył do niej Zygmunt August, który rozpoczął przebudowę Zamku Królewskiego. Rozwiązłe życie brata, który nie krył się z romansami z kobietami niskiego stanu, napawało pobożną Annę odrazą, więc rodzeństwo nie widywało się zbyt często. Niemniej śmierć brata w 1572 r.