Pochodził z rusińskiego rodu Mazepów-Kołodyńskich, których rodzinne gniazdo mieściło się we wsi Mazepińce koło Białej Cerkwi na Kijowszczyźnie. Wyznający prawosławie Mazepowie pieczętowali się herbem Kurcz i zostali uszlachceni w dobie ostatnich Jagiellonów. Rusińska szlachta w Rzeczpospolitej – mimo zrównania w prawach z polską oraz litewską – napotykała jednak wiele barier, bijąc głową w szklany sufit. Stąd nie tak znowu rzadki udział środniozamożnych herbowych Rusinów w kozackich rebeliach i Mazepowie nie byli tu wyjątkiem. Przodek przyszłego hetmana, Fiodor Mazepa, brał udział w powstaniach Kosińskiego i Nalewajki w XVI w., za co został stracony. Również ojciec Iwana, Stefan Mazepa, był ważnym atamanem u boku Bohdana Chmielnickiego. Później odegrał istotną rolę w zaprowadzeniu pokoju na Ukrainie oraz podpisaniu unii hadziackiej z Rzeczpospolitą w 1658 r. W nagrodę powierzono mu urząd podczaszego czernihowskiego. Jego zasługi musiały być znaczne, skoro jego syna przyjęto na dwór króla Jana Kazimierza w charakterze królewskiego pazia.
Szlachcic Kołodyński
Iwan Mazepa trafił na dwór jako gruntownie wykształcony młodzieniec: pobierał nauki w kolegium Kijowsko-Mohylańskim oraz Jezuickim w Warszawie. Znał też kilka języków: polski, rosyjski, łacinę i niemiecki. Jako dworzanin Jana Kazimierza brał udział w licznych misjach dyplomatycznych: odwiedził Francję i Włochy. Z czasem stał się kimś w rodzaju specjalnego wysłannika króla na Ukrainę – był m.in. członkiem poselstwa wiozącego buławę hetmańską Pawłowi Teterze. Mimo wszystko polscy katoliccy dworzanie nie dawali mu zapomnieć, że był szlachcicem niejako drugiego gatunku. Zaciekłym wrogiem Mazepy na dworze był słynny Jan Chryzostom Pasek, który w swoich „Pamiętnikach” stale wytykał mu, że „trochę szalbierz, a do tego kozak, niedawno nobilitowany”.