Za zamkniętymi drzwiami laboratorium. Badanie na obecność SARS-CoV-2 krok po kroku

Jak przebiega i jak długo trwa test na obecność koronawirusa? Czy to niebezpieczne? Oto jak wygląda dzień z życia superlaboratorium, które wykonuje jedno z najbardziej pożądanych badań na świecie.

Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Uczelniane Centrum Aparaturowe. Do niedawna prężnie realizowało rozmaite projekty naukowe, dziś wszystko, co tu się dzieje, dotyczy już tylko jednego tematu: koronawirusa. Wieloprofilowe laboratorium w ekspresowym tempie przystosowano do wymogów jednostki wirusologicznej o standardzie BSL-2. Nad wszystkim czuwał jego kierownik – prof. dr hab. Krzysztof Książek, laureat Nagrody Naukowej „Polityki” 2010. – Odebrałem telefon: „Słuchaj, jest taki pomysł, żeby uruchomić u ciebie diagnostykę koronawirusa”. Sprawdziliśmy więc, czy w ogóle możemy spełnić wymagania. Na tamten moment diagnostykę mogły prowadzić tylko laboratoria o standardzie BSL-3 – w Polsce są trzy takie jednostki. Jednak jeszcze tego samego dnia ministerstwo dopuściło diagnostykę SARS-CoV-2 w warunkach BSL-2. Natychmiast ruszyliśmy z przygotowaniami.

W cztery dni dokonano całkowitej reorganizacji laboratorium: wydzielono pomieszczenia do poszczególnych zadań, przygotowano pokoje rezerwowe, skompletowano cały potrzebny sprzęt, usunięto wszystko, co niepotrzebne. Na pierwszym miejscu postawiono zapewnienie bezpieczeństwa. – Mamy lampy UV, dezynfekujące maty ze srebrem aktywnym, przepływowe oczyszczacze powietrza, sześć komór laminarnych wysokiej klasy wyposażonych w nowe filtry – wymienia prof. Książek. Skompletowano też zespół, złożony głównie z pracowników uczelni i liczący już blisko 40 osób. 20 marca 2020 r. laboratorium było gotowe do przyjęcia pierwszych próbek. To drugie po sanepidzie miejsce diagnostyki SARS-CoV-2 w Wielkopolsce.

Na froncie walki z SARS-CoV-2. Dzień z życia superlaboratorium

Praca w laboratorium rozpoczyna się o godz. 8, ale chwilę po 7 cały zespół jest w pogotowiu. Panuje atmosfera skupienia, poszczególne grupy przygotowują się do działań. Najważniejsze jest odpowiednie zabezpieczenie: dezynfekcja, kombinezony, maseczki, przyłbice, rękawiczki, ochraniacze na nogi. Jedno jest pewne: pracy będzie sporo. W pierwszym tygodniu działalności laboratorium przeanalizowało 466 próbek (dziewięć dało wynik dodatni) – wszystkie nie później niż po 24 godzinach od dostarczenia przez Wojewódzką Stację Sanitarno-Epidemiologiczną. Teraz próbki do laboratorium UMP kierowane są również ze szpitali klinicznych oraz innych podmiotów ochrony zdrowia, które zawrą z uczelnią stosowną umowę. Po dwóch tygodniach od momentu uruchomienia laboratorium przeprowadzono ponad 1400 testów.

Uniwersytet Medyczny w PoznaniuPraca z materiałem zakaźnym wymaga odpowiedniego przygotowania i stosowania środków ochrony osobistej (po lewej). Pracownicy uczelni mogą liczyć na wolontaryjną pomoc studentów (po prawej), głównie analityki medycznej i kierunku lekarskiego, którzy uczestniczą w pracach administracyjnych laboratorium diagnostycznego SARS-CoV-2.

Pierwsze próbki – wymazówki z płynnym podłożem – docierają do punktu odbioru materiału biologicznego jeszcze przed godz. 8. Materiał biologiczny zabezpieczony jest na zasadzie potrójnego opakowania. Studenci wolontariusze, pierwsza linia frontu, przyjmują materiał, kodują i wprowadzają do rejestru i wewnętrznego systemu informatycznego.

Całość trafia wtedy do wydzielonego pomieszczenia. Tu do akcji wkraczają „kosmonauci” – biotechnolodzy, biolodzy molekularni i diagności laboratoryjni przebrani w specjalne kombinezony, w pełnym rynsztunku ochronnym. Przelewają płynne podłoże z wymazówki do probówki przystosowanej do mrożenia – ten etap wymaga największej ostrożności – i umieszczają w temp. –20 st. C. W takich warunkach próbki czekają, aż zbierze się ich wystarczająca liczba do rozpoczęcia newralgicznego etapu izolacji RNA wirusa. Dlaczego? – Praca w szczelnej odzieży ochronnej, w kilka osób, w relatywnie niedużym pomieszczeniu, jest dużym obciążeniem fizycznym, do którego dochodzi ponadprzeciętne skupienie związane z pracą nad materiałem niebezpiecznym. Aby efektywnie opracować materiał pochodzący z ok. 50 próbek, konieczne jest spędzenie w pracowni ok. trzech–czterech godzin, co powoduje, że z punktu widzenia wydajności, ekonomiki pracy oraz bezpieczeństwa personelu racjonalne jest rozpoczynanie cyklu izolacji nie z jedną, lecz z większą liczbą próbek – tłumaczy prof. Książek.

Manualna izolacja jednoniciowego RNA: odczynniki, metoda kolumienkowa i skupienie

Po rozmrożeniu pakietu próbek następuje właściwa izolacja materiału genetycznego koronawirusa, czyli jednoniciowego RNA. Wszystko odbywa się manualnie. Materiał poddawany jest działaniu odczynników lizujących, w wyniku czego następuje zniszczenie białek kapsydu wirusa. Korzystając z metody kolumienkowej, pracujący w skupieniu personel wyodrębnia i oczyszcza RNA – trzeba pozbyć się zanieczyszczeń, m.in. białka i polisacharydów. – Izolacja to absolutnie najdłuższy proces. Z uwzględnieniem etapu przelewania, bo on również jest elementem toku izolacji, zajmuje nam to trzy–cztery godziny, a nawet pięć, gdy pracujemy na bardzo dużej liczbie próbek – wyjaśnia prof. Książek. W laboratorium jest już automatyczny izolator, ale czeka jeszcze na komplet dedykowanych odczynników. Uczelnia zabiega o zakup kolejnych automatycznych izolatorów o większej przepustowości, których pozyskanie w sposób znaczący odciążyłoby grupę „izolatorów”, zwielokrotniając zarazem liczbę próbek poddawanych izolacji w jednostce czasu.

Uniwersytet Medyczny w PoznaniuJaskinia lwa – pokój izolacji materiału genetycznego. Po kilku godzinach manualnej izolacji jeden zespół może odpocząć. Szykuje się natomiast drugi – przeprowadzający badanie PCR.

Pięć godzin później – czas na real-time PCR

Jest już popołudnie, wyizolowany materiał genetyczny jest gotowy na kolejny, finalny etap badań. Trafia on do osobnego pomieszczenia, w którym znajdują się termocyklery. Przy ich zastosowaniu naukowcy, wykorzystując certyfikowany zestaw do analizy SARS-CoV-2, przeprowadzą łańcuchową reakcję polimerazy z analizą przyrostu produktu w czasie rzeczywistym (real-time PCR).

Zanim to jednak nastąpi, potrzebne jest przepisanie RNA – wszak to ono stanowi materiał genetyczny koronawirusa – na DNA. W tym celu badacze wykorzystują odwrotną transkryptazę. Dopiero po tym procesie materiał, umieszczony w probówkach z odpowiednimi odczynnikami, w tym sondami fluorescencyjnymi, wprowadzany jest do termocyklera. Laboratorium posiada aż cztery takie urządzenia, choć na tę chwilę potrzebuje jednego – trzy pozostałe stanowią rezerwę. Korzystając z pojedynczego urządzenia, w jednym rzucie naukowcy mogą poddać analizie real-time PCR materiał wyizolowany od 46 pacjentów. Do każdej płytki, na której wykonywana jest analiza, dodawane są kontrole reakcji, pozytywna i negatywna.

Uniwersytet Medyczny w PoznaniuTo tu w końcu wiadomo, czy otrzymane przez laboratorium próbki zawierały koronawirusa, czy nie. Pozostaje już tylko przesłać raport do instytucji zlecającej badanie.

W laboratorium przeprowadzana jest amplifikacja dwóch genów: genu E, kodującego białko otoczki wirusa, oraz genu RdRP, kodującego RNA-zależną polimerazę RNA SARS-CoV-2. – Żeby potwierdzić obecność koronawirusa, musimy wykazać ekspresję obu genów. W przypadku stwierdzenia tylko jednego z nich wynik traktujemy jako wątpliwy i powtarzamy badanie. W przypadku ponownego uzyskania wyniku wątpliwego, rekomendujemy ponowne wykonanie wymazu i powtórzenie całej analizy – wyjaśnia prof. Książek.

Na ekranie śledzone są wyniki kolejnych cykli powielania materiału genetycznego – jeżeli sonda fluorescencyjna przyłączy się do poszukiwanej sekwencji, krzywe rejestrowanego sygnału będą systematycznie rosnąć. W prowadzonej analizie uwzględniana jest także kontrola pozytywna, czyli taka, dla której wynik zawsze powinien być dodatni. Dają one sygnał przy 35.–37. cyklu. W próbkach niektórych pacjentów, które są właśnie analizowane, sygnały pojawiają się już przy 19. amplifikacji, choć zazwyczaj jednoznaczny sygnał pojawia się w okolicy 30. – Im wcześniejsze pojawienie się sygnału, z tym większą wiremią zmaga się pacjent – na gorąco komentuje prof. Książek. By potwierdzić obecność SARS-CoV-2, potrzeba od 30 do 37 cykli. Brak obecności wirusa uznaje się, gdy do 39., 40. cyklu reakcji nie ma detekcji sygnału ani jednej, ani drugiej poszukiwanej sekwencji genowej. Po kolejnych dwóch godzinach pracy przeznaczonej na reakcje PCR badacze mogą na chwilę odetchnąć. Kolejna partia próbek została przebadana. Pozostaje już tylko przygotować i wysłać raport z wynikami.

Testować, testować, testować – dopóki będzie trzeba

Jak długo będzie działało laboratorium diagnostyki koronawirusa SARS-CoV-2 na Uniwersytecie Medycznym w Poznaniu? Prof. Krzysztof Książek zapowiada, że tak długo, jak tylko będzie to potrzebne. – Musimy być bardzo ostrożni i za wszelką cenę chronić się przed zakażeniem. Stwierdzenie wirusa pośród personelu wyłączy z pracy całe laboratorium. Aby tego uniknąć, dążymy do wyodrębnienia stałych zespołów, których kontakt między sobą będzie ograniczony do minimum. Bardzo się obawiamy jakichkolwiek dodatkowych kontaktów, a także wprowadzania w proces diagnostyczny kolejnych osób, choć bardzo ich też potrzebujemy, by byli naszymi zmiennikami. Jako obowiązkowe wprowadziliśmy noszenie maseczek i jednorazowych fartuchów przez każdą osobę wchodzącą do laboratorium, nawet do części administracyjnej – wyjaśnia.

Liczba przypadków zakażenia koronawirusem w Polsce cały czas rośnie. Taka działalność jak na poznańskiej uczelni medycznej jest w sytuacji pandemii na wagę złota – im więcej testów, tym szybsza izolacja osób chorych i tych, które miały z nimi styczność. Jak stwierdził niedawno Tedros Adhanom Ghebreyesus, dyrektor generalny Światowej Organizacji Zdrowia: „Nasza rekomendacja dla wszystkich krajów jest prosta: testować, testować, testować. Badajcie każdego, u którego jest cień podejrzenia zakażenia!”.